2014年日本高中老師無殼孵化小雞論文

一種使用塑料薄膜作為培養容器的新型無殼雞胚胎培養系統(A Novel Shell-less Culture System for Chick Embryos Using a Plastic Film as Culture Vessels)

最近朋友想做無殼孵小雞的實驗,找來了日本中學老師的論文,翻譯了一下。希望能幫到之后的工作。

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摘要

高孵化率的鳥類胚胎無殼培養方法的發展,對于有效繁殖轉基因雞,胚胎操作,組織工程學,以及再生醫學的基礎研究是有幫助的。目前為止,鳥類胚胎的培養方法包括使用窄窗口蛋殼的整胚胎培養,代用蛋殼,以及使用透氣薄膜的人造容器。為了建立高孵化率的簡單雞胚胎培養方法,我們實驗了不同的培養條件,包括補充鈣質和通入氧氣。在孵化55-56小時后轉移的胚胎培養中,使用聚甲基戊烯薄膜作為培養容器,同時補充乳酸鈣和蒸餾水的情況下,超過90%的胚胎活到了第17天。為17天的胚胎通入純氧,最終產生了57.1%(14個中的8個)的孵化成功率。因此,我們使用人工容器方法成功實現了高孵化率。
關鍵字:人工容器,雞胚胎培養,孵化,無殼,聚甲基戊烯

引言

無殼培養,即把雞胚胎從蛋殼中取出并在人工環境中培養,是生產轉基因雞的重要技術,它們的蛋中可以產生各種胚胎操作中有用的物質 (Kamihira 等人, 2005; Kyogoku 等人, 2008)。另外,如果這項技術應用到拯救損壞的蛋,可以幫助珍稀鳥類的保護。然而,蛋殼的開窗導入基因以及其他的操作會顯著降低孵化成功率(Andacht 等人,2004)。通過直接觀察胚胎的發育,雞胚胎的無殼培養技術也可能在學校的生命科學教育中扮演重要的角色。
Perry(1988)報告了使用替代蛋殼作為培養容器的雞胚胎培養方法,用于從雌性輸卵管中取出的單細胞受精卵的前卵(ex ovo)培養。這種方法由三個系統組成:系統I用于從單細胞狀態到胚盤狀態的胚胎,系統II用于胚盤狀態到第3天的胚胎,系統III用于從第3天到孵化成功的胚胎。胚胎在三個系統中培養并且從一個容器轉移到另一個容器。一個大蛋殼被用作系統III的培養容器。然而,這種方法的孵化成功率只有7% ,之后Naito 等人在1990年把它提高到50%左右。一些培養方法使用代用蛋殼培養鵪鶉(Ono 等人., 1994;Kamihira 等人., 1998; Ono 等人., 2005; Kato 等人., 2013)
Kamihira 等人(1998)年報告了使用PTFE透氧膜構成的人造容器的鵪鶉胚胎的無殼培養技術。在他們的方法中,超過43%的鵪鶉胚胎在補充鈣的條件下孵化成功。這個系統對應于Perry的系統III,并且這種培養方法同樣被用于雞胚胎 (Kamihira 等人.,
2004)。
雞胚胎培養的各種改建都被報道了,然而,許多方法都包括了用從產更大卵的不同種鳥類得到的蛋殼作為代用蛋殼,如aigamo 鴨和火雞(Borwornpinyo 等人., 2005)。然而,使用代用蛋殼的培養方法有很多弊端,如準備蛋殼,不同批次蛋殼的差異,無法循環利用,和胚胎操作過程中低可操作性等。
為了建立一個高孵化成功率的簡單培育方法,我們使用方便的透明玻璃杯而不是代用蛋殼作為人工容器,并且試驗了如補充鈣和水,以及通入氧氣等培養條件。

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圖1 **處理聚甲基戊烯膜。** 為了準備培養容器,握住大約30平方厘米的薄膜的左右兩邊并拉伸到合適的形狀(A)。然后,握住保持松弛的邊以同樣的方式拉伸薄膜(B)。這樣就造出了一個蛋形狀并且和蛋尺寸相當的薄膜。之后薄膜被裝有塑料杯的吸氣機吸氣,塑料杯與人造容器直徑相同。這也是防止薄膜在裝到人造容器上時起皺。

材料和方法

雞蛋

本研究使用的所有受精卵都是Dekalb 棕雞蛋,一種從雜貨店買到的雞蛋(Yamagishism Jikkenchi, Mie, Japan)

培養容器

一個430ml的聚苯乙烯塑料杯用作培養容器的囊。在距離杯子底部大約2cm的位置開一個直徑1-1.5cm的洞,洞口堵上棉絮作為過濾器。一個直徑2mm的塑料管(源自多用途管,日本東京原子醫藥生產)插入棉絮和洞之間的空隙提供氧氣供應。杯子中加入40ml 0.01%的氯化苯甲烴胺溶液(OSUBAN-S,日本制藥生產;用蒸餾水稀釋)。聚甲基戊烯膜(FOR-WRAP,日本理研公司生產)被制成凹陷形狀,小心地防止收縮(圖1)然后作為人造培養容器裝到杯子上。

胚胎培養

受精雞蛋在38℃,相對濕度60%的孵化器(BITEC-300,Shimadzu RIKA 公司生產)中預培養48-50小時(A組)或55-60小時(B組)。作為胚胎培養的準備,向培養容器中加入250-300mg乳酸鈣五水合物粉末(昭和化學生產)。然后輕輕地加入2.5-3ml無菌蒸餾水(大冢制藥生產)。每個蛋殼用70%乙醇擦拭,不用鉆頭打破,整個雞蛋的內容轉移到培養容器(圖2 B)。果破碎的蛋殼掉進培養容器,用消毒的醫用鉗小心取出。
進一步,我們在聚甲基戊烯薄膜上表面做了10個直徑5-8mm的通氣孔,并不直接接觸胚胎。洞通過使用加熱的玻璃棒融化薄膜制成。

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圖2 **雞胚胎的人工培養容器** 這幅圖中,沒有添加氯化苯甲烴胺(胚胎轉移前,A圖)。雞胚胎人造培養容器(剛轉移完胚胎,圖B),棒,1cm

培養容器蓋上聚苯乙烯蓋子使得容器中的濕度保持在100%左右。培養容器在孵化器中保持38℃和80%濕度。培養容器傾斜大約8°放置,順時針方向旋轉120°,一天轉2次。
從培育周期的第17天開始到出殼,以大約500ml/h的速度向之前安裝的塑料管中通入純氧。

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圖3 **用于雞胚胎培養的人造培養容器示意圖**
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圖4

如果胚胎不能在培養周期的第19至20天自己突破尿囊膜,我們就會在避免大出血的前提下,小心地在鳥喙周圍創造一個5mm左右的切口。圖4顯示了雞胚胎培養的時間表。完整的沒有操作過的受精卵是受控孵化的(n=10)。他們在38℃,80%濕度的孵化箱中孵化,第18天前每天順時針旋轉兩次,每次120°。
孵化出的雞被贈與新的主人,作為寵物被養到性成熟。

統計分析

培養的胚胎在孵化周期第17天以前的存活能力由存活胚胎的數量體現,100%存活率即為開始前卵培養的那天存活胚胎的數量。提供或不提供氧氣的孵化率是由孵化成功胚胎數量體現,100%孵化率即開始通風的第17天胚胎的數量。數據使用費舍爾的精確概率法。P值<0.01被認為是有統計意義的。

結論

預孵化周期

對于孵化50小時前轉移到培養容器中的胚胎(A組;階段12-15;Hamburger與Hamilton, 1951),沒有活到第8天的。而當培養55-56小時后轉移到培養容器中的胚胎(B組,階段16),第8天的存活率明顯高于A組(P<0.01;見表1和圖5),17天的存活率為92%(25中的23)。

氧氣供應

在人工容器中培養到大約第17天(階段43-44)期間,尿囊膜血管中血流的顏色變為深紅,顯示出胚胎缺乏氧氣供應。因此,我們通過插入人工容器中的塑料管,以500ml/h的速度通入純氧。結果是,B組57.1%(14中的8)的供氧的胚胎發育到了孵化。作為對比,沒有供氧的組沒有胚胎發育到成功孵化(見表1和圖6)。因此,通入氧氣顯著提高了孵化存活率(P<0.01)。

孵化后雞的成長

本方法孵化出的雞很健康,可以養到性成熟,并且交配后得到了健康的后代。

完整蛋控制

完整控制胚胎的孵化率為70%(10中的7)并且沒有觀察到畸形。兩枚單在破殼時死亡,另一枚在孵化時由于卵黃囊破壞而死亡。

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圖5 **轉移前預孵化周期對17天存活率的影響。** 所有的蛋預孵化48-50小時(開環,A組)或55-56小時(閉環,B組) 。觀察到兩組在第8天和第17天存活率的顯著不同。
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圖6 **第17天開始是否通入純氧的胚胎的存活率和孵化率。**第17天-21天期間監控存活率同時計數孵化胚胎的個數。此期間,胚胎在通入氧氣(閉環)或不通入氧氣(開環)條件下培養。觀察到了是否供氧在第21天孵化率的顯著不同(*P*<0.01)。
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表1 **使用塑料薄膜作為培養容器孵化雞胚胎的總結。** —,不供氧;S,供氧;N,未處理。*均為第17天時

討論

當前的研究中,我們開發了一套使用塑料薄膜作為培養容器的雞胚胎無殼培養系統,并且通過比較諸如補充乳酸鈣和是否供應氧氣等因素,試驗了胚胎孵化的條件。我們沒有使用可透氣的PTFE膜,而是使用了廉價,易處理,易獲得的保鮮膜。盡管我們測試了幾種保鮮膜,包括聚乙烯和氯化聚乙二烯,最終更傾向于使用聚甲基戊烯膜因為它高度透氧(8.0X10^-10 mol/m^2sPa; 數據來自理研科技Riken Technos)。生產培養容器時消除皺褶是很重要的,因為皺褶的存在會導致更低的存活率(數據未顯示)。
在我們的研究中,胚胎在蛋殼中預孵化到第3天,之后打破蛋殼把胚胎轉移到人工容器中,對應于Perry的系統III。轉移胚胎的預培養周期影響到第8天的存活率以及轉移到培養容器的成功率。胚胎的轉移時間被優化到第3天(Rowlett and Simkiss, 1987; Borwornpinyo 等人., 2005)。在本研究中,48小時與56小時的不同預孵化周期表現出對存活率的顯著影響。預孵化55-56小時(階段16)的存活率明顯高些。在我們的預實驗中,卵黃膜經常在56小時后(階段17)轉移到培養容器時損壞。60小時后,因為損壞卵黃膜的風險,很難通過打破蛋殼轉移胚胎(數據未顯示)。
之前Kamihira等人使用鵪鶉的研究(1998)提到了乳酸鈣可以高效促進鳥類胚胎發育。在我們的培養系統中,添加乳酸鈣同樣促進了胚胎發育,并且存活率在添加250-300mg乳酸鈣時最高(數據未顯示)。因此,補充鈣對于無殼培養是很關鍵的,因為在胚胎發育期間的主要鈣質來源為蛋殼(Rowlett與 Simkiss, 1987; Kamihira 等人, 1998)。我們相信補充乳酸鈣的量足夠滿足胚胎發育的要求,盡管對于胚胎發育鈣質來源需要進一步的研究。
我們認為向人工容器中通氧氣可能造成胚胎水分的蒸發流失。因此,我們首先向培養容器中添加2.5-3ml蒸餾水。此外,當我們把乳酸鈣懸浮在蒸餾水中加進去時,存活率下降了(數據未顯示),這可能是電解質不平衡或者血鈣過高導致。因此,我們首先向培養容器中添加乳酸鈣,然后加入蒸餾水,因為這可能有助于胚胎更慢地吸收乳酸鈣。
通過本研究中的培養方法中,分布在尿囊膜中的血管在大約第17天時(階段43-44)變為暗紅色,這意味著供氧不足。Rowlett 和 Simkiss (1989)報道了培養在“保鮮膜”制成的人造容器中的雞胚胎缺氧與低碳酸血癥。Kamihira等人(1998)也指出了使用代用蛋殼的胚胎培養在后期階段的氧氣供應問題。因此,我們試驗了在培養的后半段通入氧氣。在培養的初始階段通入氧氣可能因為氧氣的毒性造成存活率下降。本研究中,尿囊膜中血流的顏色在培養初始階段看起來很正常。因此,對于第17天后的胚胎,我們通入純氧來防止后期缺氧。結果血流的顏色變為正常,并且14只有8只發育到成功孵化,證明后期供氧對于人工容器的無殼培養是至關重要的。
在第19-20天(階段45),胚胎開始戳破尿囊膜并且它們的肺呼吸系統被激活,當胚胎不能戳破尿囊膜時,我們劃開5mm長的口子助產。這可能導致戳殼后死亡,一種當蛋沒有破殼時以固定比例發生的現象。
結果顯示,使用本研究中描述的培養容器,55-56小時的預孵化,加入250-300mg乳酸鈣,2.5-3ml蒸餾水,第17天(階段43-44)后以500ml/h的速度通入純氧,我們實現了最高的孵化率。這些條件下以第17天存貨胚胎數為100%參照的孵化率為57.1%(14中的8)。
Borwornpinyo等人(2005)報告了使用火雞殼和保鮮膜作為轉移到Perry的系統III之前的培養容器的雞胚胎培養方法,實現了以第3天存活胚胎數為100%情況下81.1%的孵化率。盡管我們的培養方法沒有使用代用蛋殼,仍舊實現了超過50%的高孵化率。這種方法不需要任何復雜操作,特殊材料或技術。也消除了如不同蛋殼的可用性和質量等不確定性,這在之前使用代用蛋殼的方法中經常帶來問題。此外,我們使用透明的塑料薄膜,不光使得從任何角度觀察胚胎形態都很方便,而且只要拿走塑料蓋就可以進行胚胎操作。目前,提高孵化率的進一步改進正在進行中。
如果我們獲得了穩定的孵化率,這種方法就可幫助生產轉基因雞和其他胚胎操作,這些都是再生醫學的基礎研究。這也可以用于支持組織培養,使用鳥類的胚胎干細胞的研究以及作為生物反應器的雞蛋的批量生產。

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圖7 **從人工容器中剛孵化出的小雞**

致謝

本研究由日本科學促進會的政府補貼支持(編號23924002)。
我們非常感謝國家農業生物科學學會的Mitsuru Naito博士,日本獸醫和生命科學大學的Kimimasa Takahashi 博士。我們也非常感謝千葉縣牲畜研究中心的Masayuki Waki博士也為我們提供建議。
我們也感謝來自Masayuki Waki高中,Isobe 高中,Chiba Kogyo高中以及Oihama高中的員工和學生。
我們感謝深紅互動有限責任公司(Ulatus與Enago)協助翻譯和編輯文稿 。

參考文獻

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